مانوپارت لب: چرا برترین آزمایشگاه های جهان برای 5 دقیقه نمونه گیری، 5 ساعت برنامه ریزی می کنند؟
تصور کنید در یک آزمایشگاه، یک اشتباه کوچک در نمونهگیری تمام زحمات شما را بر باد بدهد و مسیر پژوهش را تغییر دهد. نمونهگیری و آمادهسازی نمونه هنری ظریف است که اگر کسی با بیدقتی آن را انجام دهد، حتی پیشرفتهترین گرافها هم نتایج دروغین ارائه میکنند. در این مقاله انواع روشهای نمونهگیری و اصول تکنیکهای آمادهسازی را بررسی میکنیم.
نمونه گیری (Sampling)
پژوهشگر در فرآیند نمونهگیری بخشی از جامعه را انتخاب میکند و نتایج بهدستآمده را به کل جامعه تعمیم میدهد؛ بنابراین نمونه باید نماینده واقعی کل جامعه باشد.[1]. همچنین متخصصان روشهای نمونهگیری را براساس نوع، به دو دسته احتمالی و غیراحتمالی تقسیم میکنند.
الف) 4 روش طلایی نمونه گیری احتمالی[2] :
1) نمونه گیری تصادفی ساده (Simple Random Sampling): در این روش پژوهشگر از جامعهای همگن، اعضا را بهطور کاملاً کورکورانه انتخاب میکند تا همه افراد شانس برابر داشته باشند.
مثال: از میان ۱۰۰۰ قرص تولیدشده در خط تولید، پژوهشگر ۱۰۰ قرص را بهطور تصادفی انتخاب میکند و آنها را تحلیل میکند.
2) نمونه گیری سیستماتیک (Systematic Sampling): در این روش پژوهشگر با گام ثابت از جامعه نمونهگیری میکند و این شیوه برای جوامع بزرگ و یکنواخت مناسب است.
مثال: دستگاه هر ۳۰ دقیقه بهطور خودکار نمونهای برداشت میکند و پژوهشگر آن را بررسی میکند.
3) نمونه گیری لایه ای (Stratified Sampling): در این روش پژوهشگر از هر لایه حداقل سه نمونه انتخاب میکند و این روش برای جوامع ناهمگن کارایی دارد.
مثال: محقق لایههای نفت با چگالیهای متفاوت را جدا میکند و از هر لایه نمونه میگیرد.
4) نمونه گیری خوشه ای (Cluster Sampling): در این روش پژوهشگر چند خوشه انتخاب میکند و سپس واحدهای مجاور آنها را بررسی میکند.
مثال: از میان ۱۰ خط تولید موجود در کارخانه، پژوهشگر ۳ خط را انتخاب میکند و از آنها نمونهگیری انجام میدهد.
ب) 4 روش نمونه گیری غیراحتمالی[2] :
وقتی سرعت و عملی بودن اهمیت بیشتری از تعمیم آماری دارد، پژوهشگر از روشهای غیراحتمالی استفاده میکند و با کمترین هزینه دادههای کلیدی را استخراج میکند. بنابراین این روشها اگرچه اعتبار آماری کمتری دارند، اما برای شرایط خاص کارآمدند.
1) نمونه گیری در دسترس (Convenience Sampling): در شرایطی که زمان محدود است یا فقط بخشی از نمونه باقی مانده، پژوهشگر از در دسترسترین نمونهها استفاده میکند و سریعتر به نتیجه میرسد.
مثال: محقق ۲۰ لاستیک اول تولیدشده در خط تولید را انتخاب میکند و آنها را بررسی میکند.
2) نمونه گیری هدفمند (Purposive Sampling): در این روش اپراتور با تکیه بر دانش خود از نقاط بحرانی، نمونهها را انتخاب میکند و تمرکز بیشتری روی موارد حساس دارد.
مثال: نمونهبردار از رنگهایی استفاده میکند که تاریخ انقضای آنها رو به پایان است و احتمال خطا در آنها بیشتر است.
3) نمونه گیری سهمیه ای (Quota Sampling): در این روش انتخاب نمونه بر اساس سهمیههای تعریفشده و گروههای از پیش تعیینشده انجام میشود و پژوهشگر نسبتها را بهطور دقیق رعایت میکند.
مثال: محقق ۳۰٪ نمونهها را از خط تولید A و ۷۰٪ را از خط تولید B انتخاب میکند و نتایج را با هم مقایسه میکند.
4) نمونه گیری گلوله برفی (Snowball Sampling): در این روش پژوهشگر از طریق نمونههای اولیه، نمونههای مرتبط دیگر را پیدا میکند و زنجیرهای از اطلاعات به دست میآورد.
مثال: پژوهشگر ابتدا یک محصول آلوده را شناسایی میکند و سپس با استفاده از ویژگیهای همان محصول، سایر محصولات آلوده را نیز کشف میکند.
– انتخاب روش بهینه محاسبه حجم نمونه[2] :
پژوهشگران تعیین حجم بهینه نمونه را یک چالش کلیدی در طراحی مطالعات صنعتی و فرآیند نمونه گیری میدانند، زیرا نمونه کوچک خطای آماری ایجاد میکند و نمونه بزرگ منابع را هدر میدهد. بنابراین در این بخش مقاله سه روش علمی برای محاسبه حجم نمونه معرفی میشود.
الف) فرمول مورگان ب)فرمول کوکران ج) فرمول برآورد میانگین
الف) فرمول مورگان(Morgan’s Formula) [2], [3] :
وقتی اندازه جامعه (N) نامشخص باشد و پژوهشگر نیاز به برآورد سریع حجم نمونه داشته باشد، از فرمول مورگان استفاده میکند. این فرمول سرعت و سادگی را فراهم میآورد و از جوامع کوچک تا بزرگ آماری را پوشش میدهد. همچنین این فرمول معمولاً حجم نمونهای بزرگتر از حد نیاز محاسبه میکند و به همین دلیل خطای نمونهگیری کاهش مییابد.
اما معایبی برای این روش وجود دارد؛ زیرا پژوهشگر حجم نمونه را محافظتکارانه و بسیار بزرگ به دست میآورد، امکان تنظیم پارامترها در فرمول محدود است و این روش برای دادههای کمی مناسب نیست.
پارامتر p : برابر است با احتمال وجود ماده مورد نظر در جامعه آماری که در فرآیند نمونه گیری اهمیت زیادی دارد. الف) اگر پژوهشگر دادههای پیشین را داشته باشد و بداند ۳۰٪ محصولات آلوده هستند، در این صورت p=0.3 خواهد بود. پارامتر e میزان خطای مجاز در نتایج را مشخص میکند. به عنوان مثال برای خطای ۵٪، مقدار e برابر ۰.۰۵ است که مستقیماً بر دقت نمونه گیری اثر میگذارد. پارامتر Z مقدار بحرانی توزیع نرمال استاندارد است که به سطح اطمینان بستگی دارد. پژوهشگران معمولاً در آزمایشات سه سطح اطمینان ۹۰٪، ۹۵٪ و ۹۹٪ را بهکار میبرند که مقدار Z برای هرکدام به ترتیب ۱.۶۴۵، ۱.۹۶ و ۲.۵۷۶ است. پژوهشگر این مقدار را با استفاده از منحنی توزیع نرمال به دست میآورد. |
ب) فرمول کوکران (Cochran’s Formula) [2] :یکی دیگر از روشهای تعیین حجم نمونه در فرآیند نمونه گیری، فرمول کوکران است که پژوهشگر آن را برای جوامع محدود و معلوم (N مشخص) به کار میگیرد. این روش خطای کمتری دارد و نتایج قابل اعتمادتری ارائه میدهد و برخلاف روش مورگان، پژوهشگر امکان تنظیم پارامترها را دارد. همچنین این روش دادههای کمی و کیفی را پوشش میدهد و حتی برای جوامع نامعلوم نیز تطبیقپذیر است. هرچند این روش کارآمد است، پژوهشگر آن را بهدلیل پیچیدگی بیشتر نسبت به فرمول مورگان و کارایی اندک در دادههای پیوسته مانند دما و فشار محدودکننده میداند. ازاینرو برای چنین دادههایی پژوهشگر فرمول برآورد میانگین را انتخاب میکند، زیرا استفاده از کوکران دقت نتایج را کاهش میدهد. |
ج) فرمول برآورد میانگین (Mean Estimation Formula) [2] :
پژوهشگر در مواجهه با متغیرهای کمی و پیوسته مانند دما، فشار و غلظت که به دقت بالایی نیاز دارند، فرمول برآورد میانگین را برمیگزیند. این انتخاب باعث میشود هزینهها بهینه شوند و به دلیل لحاظ کردن انحراف معیار، نمونهگیری غیرضروری انجام نشود. همچنین پژوهشگر میتواند مقدار Z را برای سطوح مختلف اطمینان تنظیم کند و حساسیت پروژه را کنترل کند.
اما برای معایب این روش نیز می توان گفت وابستگی شدیدی به انحراف معیار دارد و اگر پژوهشگر انحراف معیار را نادرست برآورد کند، خطای نمونهگیری تا ۵۰٪ افزایش مییابد.
آماده سازی نمونه (Sample Preparation)
در بسیاری از روشهای آزمایشگاهی، پژوهشگرها نمونههای خام را به دلیل پیچیدگی ماتریس[1]، غلظت پایین آنالیت[2] یا تداخل ترکیبات مزاحم مستقیماً آنالیز نمیکنند. بنابراین قبل از انجام آزمایش آمادهسازی انجام میشود تا عوامل مزاحم[3] را حذف کند. او همچنین آنالیتهای کممقدار تغلیظ[4] شوند و نمونه به فرم سازگار با دستگاه تبدیل شود.این فرآیند نقش کلیدی در موفقیت نمونه گیری و دقت نتایج دارد.
برای درک بهتر، میتوان آنالیت را مانند گلی در جنگل پرتراکم تصور کرد که ماتریس همان پوشش گیاهی اطراف آن است و پژوهشگر باید ابتدا موانع مزاحم را کنار بزند تا به هدف برسد؛ درست مانند شرایط نمونهگیری آزمایشگاهی.
این مقاله در ادامه به انواع روشهای آمادهسازی میپردازد. آمادهسازی براساس حالت انجام آن به دو دسته فیزیکی و شیمیایی (جدول 1) و براساس اصول شیمی سبز[5] و بهینهسازی فرآیند به دو دسته کلاسیک و مدرن (جدول 2) تقسیم میشود.
توجه داشته باشید پژوهشگر روش آمادهسازی نمونه را با توجه به ماهیت آنالیت، نوع ماتریس نمونه (جامد، مایع، گاز) و تجهیزات و امکانات موجود انتخاب میکند.
روش های مدرن آماده سازی نمونه، انقلابی در آزمایشگاه های امروزی ایجاد کردهاند. این تکنیک ها برپایه اصول شیمی سبز و بهینه سازی فرآیند آماده سازی نمونه طراحی شدهاند تا با کاهش مصرف انرژی و مواد شیمیایی، افزایش سرعت و کاهش پسماندهای خطرناک نه تنها دقت آنالیز را بهبود ببخشند بلکه گامی بلند به سوی پایداری محیط زیست بردارند.در کنار این موضوع، این روشها فرآیند نمونه گیری را نیز کارآمدتر میسازند و خطاهای انسانی را کاهش میدهند. در ادامه سه روش آماده سازی مدرن که شامل MAE، SPE و SFE مورد بررسی قرار خواهد گرفت.
الف) استخراج با کمک مایکروویو (MAE[6]) [13] :
همانطور که مایکروویو آب درون غذا را به سرعت گرم می کند، MAE نیز آب درون سلول های گیاهی را هدف می گیرد. همانطور که در پخت ذرت بو داده گرما موجب ترکیدن دانهها میشود، در این روش نیز گرمایش سریع از داخل، دیواره سلولها را میشکند و ترکیبات داخلی را آزاد میکند.
این دستگاه برای استخراج مواد مفید از ماتریس های جامد مانند گیاهان، خاک، پلیمر یا غذا میباشد. اساس کار این دستگاه به طور ساده شامل مراحل زیر است:
1) امواج مایکروویو مستقیما به مولکول های آب و مواد قطبی [7]در نمونه نفوذ میکنند.
2) این امواج باعث جنبش سریع مولکولها و ایجاد اصطکاک بین آنها میگردد.
3) این جنبش، باعث گرم شدن از درون نمونه (برخلاف روشهای قدیمی که به سطح بیرونی گرما میدهند) میشود.
4) امواج مانند یک سلولشکن، دیواره سلولها را میشکند و مواد مفید (مانند داروها، رنگدانه ها و…) را آزاد میکند.
5) مواد مفید را در حلال (مثل آب و الکل) حل میکنند و درنهایت این مخلوط را برای آنالیزهای شیمیایی استفاده میکنند.
به عنوان جمع بندی، می توان گفت این روش برای نمونه های حجیم صنعتی به دلیل سرعت و کاهش مصرف حلال گزینه بهتری است، اما برای پروژه های با بودجه محدود یا ترکیبات بسیار حساس روش های جایگزین مانند استخراج با سیال فوق بحرانی (SFE) ممکن است مناسب تر باشد.
ب) استخراج با سیال فوق بحرانی (SFE[8]) [14] و [15] :
سیال فوق بحرانی چیست؟ حالتی منحصر به فرد از ماده(درحالت گازی) است که وقتی تحت دما و فشار خاصی قرار میگیرد، ایجاد میشود. در این حالت: الف) ماده خاصیت نفوذ پذیری گاز را دارد. (مثل بخار آب که به راحتی در فضا پخش میشود.) ب) ماده قدرت حل کنندگی مایع را دارد. (مثل آب که میتواند شکر را در خود حل کند.) مثال: دی اکسید کربن در شرایط عادی یک گاز است اما وقتی در دمای 31 درجه سانتی گراد و فشار 71 بار قرار بگیرد به حالت فوق بحرانی می رسد. |
استخراج با سیال فوق بحرانی همانند عملکرد یک قهوه ساز اسپرسوی پیشرفته است که با اعمال فشار و دمای کنترل شده، دقیقا همان موادی را که میخواهیم (مانند کافئین و …) از نمونه (دانه قهوه) استخراج میکند.
SFE یک روش استخراج مدرن و هوشمندانه است که از قدرت سیالات فوق بحرانی برای جداسازی مواد ارزشمند از گیاهان، مواد غذایی و دیگر نمونه های طبیعی استفاده میکند. اساس کار این دستگاه به طور ساده شامل مراحل زیر است:
- ابتدا گیاه خشک شده یا هر نمونه دیگری باید به حالت پودری درآید و در محفظه استخراج دستگاه قرار گیرد.
- گاز CO2 تحت فشار و دمای کنترل شده قرار می گیرد و حالت آن از گاز تبدیل به سیال فوق بحرانی می شود.
- سیال فوق بحرانی در نمونه نفوذ کرده و آن را حل می کند.
- در ادامه با کاهش فشار، CO2 به گاز تبدیل شده و مواد باقی می مانند.
- درنهایت، مواد استخراج شده برای آنالیز استفاده شده و گاز برای استفاده مجدد جمع آوری می شود.
باوجود قابلیت های منحصر به فرد SFE در استخراج انتخابی و کارآمد ترکیبات از ماتریس های جامد، این روش برای نمونه های مایع کارایی محدودی دارد. اینجاست که استخراج فاز جامد (SPE) به عنوان تکمیل کننده طبیعی SFE وارد صحنه میشود و راه حل مناسبی برای پالایش و تغلیظ نمونه های مایع ارائه می دهد. این دو روش درکنار هم مجموعه کاملی از تکنیک های استخراج را برای آنالیز نمونه های مختلف دراختیار محققان قرار می دهند.
ج) استخراج فاز جامد (SPE[11]) [16] و [17] :
این روش استخراج را میتوان به سیستم فیلتراسیون هوشمندی تشبیه کرد که همچون یک دروازهبان دقیق، تنها مولکولهای هدف را از میان انبوه ناخالصیها جدا میسازد. در این روش، مواد مفید از مایعات پیچیده جدا میشود و برای جداسازی جامدات طراحی شده است و اساس کار آن به شرح زیر است:
- آماده کردن فیلتر دستگاه (دارای ماده جاذب) که شامل چند مرحله است: شستشوی فیلتر با حلال قطبی جهت حذف آلودگی، شستشو با حلال آب یا بافر [12]جهت ایجاد محیط مناسب برای نمونه و خارج کردن حلال های وارد شده جهت حذف رطوبت.
- عبور دادن محلول از فیلتر دستگاه
- چسبیدن مواد جامد مورد نظر به فیلتر و عبور مایعات.
- جدا کردن مواد جامد از صافی توسط یک حلال قوی.
بدین صورت، ماده جامد مورد نظر از محلول مایع جدا میشود و مورد استفاده یا آنالیز قرار میگیرد.
نتیجه گیری:
انتخاب روش مناسب نمونهگیری و آمادهسازی نمونه نقش تعیینکنندهای در دقت و صحت نتایج آزمایشگاهی دارد. همانطور که در این مقاله بررسی شد، روشهای احتمالی (مانند نمونهگیری تصادفی ساده، سیستماتیک و لایهای) و غیراحتمالی (مانند نمونهگیری هدفمند و سهمیهای) هرکدام با توجه به نوع جامعه آماری و اهداف آزمایش، کاربردهای خاص خود را دارند. برای مثال، در نمونهگیری از مواد ناهمگن مانند خاک یا ترکیبات صنعتی، روشهای لایهای یا تصادفی ساده با حجم نمونه محاسبهشده بر اساس فرمولهای آماری (مانند کوکران یا مورگان) ضروری است تا از نمایندهبودن نمونه اطمینان حاصل شود.
از سوی دیگر، روشهای نوین آمادهسازی نمونه مانند استخراج با کمک مایکروویو (MAE)، استخراج با سیال فوق بحرانی (SFE) و استخراج فاز جامد (SPE) با کاهش زمان، هزینه و مصرف حلالهای خطرناک، انقلابی در آنالیزهای آزمایشگاهی ایجاد کردهاند. این تکنیکها با بهرهگیری از اصول شیمی سبز نه تنها کارایی فرآیندها را افزایش میدهند بلکه آلایندگی زیست محیطی را نیز به حداقل میرسانند که گامهای بلندی در جهت بهینهسازی هستند.
تلفیق علم آمار با تکنیکهای آزمایشگاهی نیز خطاهای سیستماتیک را به حداقل رسانده و کیفیت دادهها را بهبود بخشیده است. برای مثال به کارگیری روشهای آماری در تعیین حجم نمونه یا تحلیل عدم قطعیت نتایج از اتلاف منابع و انتشار نتایج نادرست جلوگیری میکند.
در نهایت، با به کارگیری اصول جامع ارائهشده در این مقاله (از انتخاب روش نمونهگیری تا پیادهسازی تکنیکهای پیشرفته آمادهسازی نمونه)، پژوهشگران و صنایع میتوانند به نتایج قابل اطمینانتری در حوزههای مختلف از جمله کنترل کیفیت محصولات، پایش زیست محیطی و… دست یابند. امید است این مرور جامع بر اصول نمونهگیری و آمادهسازی نمونه، زمینهساز انتخاب آگاهانهتر توسط متخصصان گردد و گامی در جهت ارتقای کیفیت نتایج پژوهشهای علمی و فرآیندهای صنعتی باشد. همچنین توجه به توسعه روشهای مدرنتر و استفاده از هوش مصنوعی در آینده میتواند افقهای جدیدی در این حوزه بگشاید.
تعاریف و اصطلاحات:
[1] مواد اصلی تشکیل دهنده نمونه که آنالیت در آن قرار دارد.
[2] ماده ای که به عنوان هدف برای شناسایی یا اندازه گیری در یک نمونه است.
[3] هر ماده ای در نمونه که تداخل ایجاد می کند.
[4] فرآیند افزایش مقدار آنالیت در نمونه برای بهبود تشخیص
[5] طراحی فرآیندهای شیمیایی کم خطر، پایدار، کارآمد و سازگار با محیط زیست
[6] Microwave-Assisted Extraction
[7] موادی مثل آب و الکل ها که دارای بار الکتریکی ناهمسان هستند.
[8] Supercritical Fluid Extraction
[9] Essential Oils
[10] Vitamins
[11] Solid Phase Extraction
[12] محلولی که با ثابت نگه داشتن pH، محیط را پایدار می کند.
منابع:
1.https://fa.wikipedia.org/wiki/%D9%86%D9%85%D9%88%D9%86%D9%87_(%D8%A2%D9%85%D8%A7%D8%B1)
- Cochran, W. G. (1977). *Sampling Techniques* (3rd ed.). Wiley.
- Krejcie, R. V., & Morgan, D. W. (1970). Determining Sample Size for Research Activities. *Educational and Psychological Measurement*, 30(3), 607–610.
- Harris, D. C. (2022). *Quantitative Chemical Analysis* (10th ed.). W. H. Freeman.
- Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2022). *Principles of Instrumental Analysis* (7th ed.). Cengage Learning.
- Pawliszyn, J. (2023). *Handbook of Solid Phase Microextraction* (2nd ed.). Elsevier.
- EPA Method 3051A (2007). *Microwave Assisted Acid Digestion*.
- ASTM E877-23 (2023). *Standard Practice for Sampling and Sample Preparation of Iron Ores*.
- ISO 11648-1:2023. *Statistical Aspects of Sampling from Bulk Materials*.
- Pawliszyn, J. (2012). *Handbook of Solid Phase Microextraction*. Elsevier.
- Luque de Castro, M. D., & Priego-Capote, F. (2023). *Modern Sample Preparation Techniques: Evolution or Revolution?* Journal of Chromatography A, 1705, 464321.
- Dean, J. R., & Rizvi, S. H. (2021). *Extraction Techniques in Analytical Sciences* (2nd ed.). Wiley.
- Eskilsson, C. S., & Björklund, E. (2000).*Analytical-scale microwave-assisted extraction.* Journal of Chromatography A, 902(1), 227-250. [DOI: 10.1016/S0021-9673(00)00769-1]
- Bruno, T. J., & Ely, J. F. (Eds.). (1991). *Supercritical Fluid Technology: Reviews in Modern Theory and Applications.* CRC Press.
- Herrero, M., et al. (2010).*Supercritical fluid extraction: Recent advances and applications.*JournalofChromatographyA,1217(16),24952511.[DOI:10.1016/j.chroma.2009.12.019]
- Simpson, N. J. K. (Ed.). (2000).*Solid-Phase Extraction: Principles, Techniques, and Applications.* Marcel Dekker.
- Hennion, M. C. (1999).*Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography.*Journal of Chromatography A, 856(1-2), 3-54.[DOI: 10.1016/S0021-9673(99)00832-8]